¿Cómo hacer una bacteria borracha o apañar la ruta metabólica de un clostridio para producir etanol?

Nos encontramos actualmente en una época en la que se produce una gran demanda de producción de etanol, y pese al título de la entrada, no para emborrachar bacterias o personas. La necesidad industrial del etanol en la sociedad actual va para industria, en muy diferentes campos; uno de los más importantes es la producción de bioetanol, teniendo en cuenta los problemas con el agotamiento del petróleo del mundo contemporáneo y su incremento de precio.

Saccharomyces cerevisiae

Se sabe que el microorganismo más eficiente en la producción en la producción de este alcohol es la levadura Saccharomyces cerevisae, seguida por las bacterias del género Clostridium. Pese a este segundo puesto el uso de estos microorganismos presenta ventajas sobre el uso de levaduras. La principal es la capacidad que tienen de usar como sustrato, es decir, como alimento para su desarrollo y la producción de etanol, azúcares que presentan en su estructura anillos de 5 ó 6 carbonos (pentosas y hexosas), a diferencia de la levadura, que sólo usa hexosas.

Los clostridios se caracteriza por tener un metabolismo fermentativo conocido como bifásico, debido a que se produce en dos tiempos. La primera fase, de crecimiento, se caracteriza porque el microorganismo toma azúcares del medio y los metaboliza hasta convertirlo en ácidos como el butírico o el acético, por lo que se conoce como acidogéneis; mientras que en la segunda fase, estacionaria, es decir, no se produce un aumento de la población bacteriana, se producen solventes orgánicos, como la acetona, el etanol y el butanol; esta parte del metabolismo se conoce como solventogénesis. Estas tres sustancias son las que dan nombre a la fermentación que producen este generación: la fermentación ABE. Si quieres ver un esquema de la ruta, pulsa aquí.

Un concepto importante a tener en cuenta para este post es el flujo de carbono, es decir, el camino, la ruta por la que va pasando este elemento. El carbono es igual para todos los metabolitos, pero la célula tiene mecanismos para dirigirlo hacia unos productos u otros, en función de sus necesidades. Pues bien, ya sabiendo esto, en el artículo que os voy a ir desgranando en este post los investigadores buscan redirigir el flujo de carbono hacia el etanol, en lugar de que se dirija hacia la acetona o los ácidos. Para ello, se pueden bloquear distintas enzimas para que se dejen de producir metabolitos indeseados, pero la enzima que se decide atacar es la Hbd o 3-hidroxibutiril-Coenzima A deshidrogenasa que aparece justo después del desvío de un metabolito intermedio hacia la producción de acetona. Esto hace que sólo nos queden dos de los tres solventes que mencionamos a la hora de definir la fermentación ABE, el etanol y la acetona… ¡EA!  (tenía que decirlo).

Hasta aquí todo muy bien, pero la pregunta es: ¿cómo se elimina una enzima? O como diría un biotecnólogo: “¿Cómo se genera un knock-out?”

Hasta ahora para generar un knock-out lo que se hacía era eliminar el gen por doble recombinación, que será contada en otro post, pero este método se ha visto que es poco eficiente para las bacterias del género Clostridium. Para ello se diseñó un sistema conocido como ClosTron. En esta aproximación lo que se hace es introducir en la secuencia especial, el intrón. Esta clase de regiones de DNA no se traducen a proteína, además, aplicando el sistema del ClosTron no se introduce exactamente por recombinación entre el DNA del plásmido en el que va clonado y el cromosoma bacteriano, sino que se da por la aparición de un RNA intermedio. Esto hace que la eficiencia de la introducción de la mutación aumente. Pues muy bien, gracias a la introducción de este fragmento de 69/70 pares de bases (bp), podemos bloquear la expresión del gen de interés, la Hbd. Este fragmento se clona en un plásmido y se transforma la bacteria con él utilizando un método conocido como electroporación, que consiste en pegarle un calambrazo a la bacteria, de tal forma que, momentáneamente, se abren poros en la membrana bacteriana y el ADN que queremos introducir pasa a la célula. Claro, después de este “shock” se le dan mimitos, un medio que le guste para crecer y así se recupera y ya podemos seleccionar las bacterias que hayan introducido nuestro plásmido. Para hacer esto hay un sistemas “muy apañao” que consiste en que los plásmidos, además del gen de interés, presentan una gen que les confiere una resistencia a un antibiótico, así que lo único que se debe hacer es cultivar el microorganismo en una placa que contenga esta sustancia, así, los que no posean el plásmido mueren por acción del antibiótico y las colonias que sobreviven son portadores de nuestro plásmido.

Clostridium acetobutylicum

Una vez hecho esto, analizamos la actividad productora de etanol de nuestro Clostridium acetobutylicum, se cultivan en modo “batch”, esto es de forma discontinua, teniendo a nuestra bacteria en un medio líquido sin alimentación hasta que nosotros queramos o hasta que agote los nutrientes. Si analizamos los productos, vemos que no aparecen metabolitos 4C (con cuatro carbonos, que serían el butanol y el butirato, por lo cual podemos concluir que SÍ que se ha producido una disrupción de la ruta metabólica antes de que se produzcan dichas sustancias. Pero no todo va a ser tan bonito, se observa a la vez que el mutante crece a un ritmo más lento que el nativo.

Se sabe que la cantidad de glucosa en el medio es el factor limitante para la producción de etanol, por lo que deciden hacer una mejora en el sistema anterior de cultivo, alimentándolo con glucosa y evitar así el agotamiento de este sustrato. Con este método se observa que el crecimiento del microorganismo es más lento, pero que produce más etanol y además aumenta el rendimiento (es decir, la cantidad de etanol generado por la cantidad de glucosa consumida).

Se decide probar también la producción de etanol partiendo de otro de las clases de azúcares que os mencioné al principio, una pentosa, en este caso, la xilosa haciéndose un cultivo “batch”. Se observó que el consumo de este azúcar es más lento, pero se obtiene una producción mayor de etanol que en el “batch” de glucosa, pese a presentar una productividad menor (cantidad de producto por el volumen y el tiempo que tarda en generarlo).

Así que, como podemos ver, gracias a este método tan novedoso, aplicando una técnica tan de vanguardia como la del ClosTron conseguimos aumentar la producción de un metabolito tan interesante como el etanol, reduciendo la producción de otras sustancias que no resultan menos interesantes, el butanol, en este caso, sola y exclusivamente quitándonos un gen de por medio.

Fuentes: Switching Clostridium acetobutylicum to an ethanol producer by disruption of the butyrate/butanol fermentative pathway. Dörte Lehmann, Tina Lüke.Eversloh. Metabolic engineering (2011)

The ClosTron: A universal gene knock-out system for the genus Clostridium. J. T. Heap et al. Journal of Microbiological Methods (2007)

Generación de un nuevo antibiótico por ingeniería metabólica

Actualmente uno de los mercados más fuertes dentro de la biotecnología son los antibióticos, esas sustancias que nos meten por los ojos y oídos por todos lados ante el imperativo de no tomarlos a la ligera para evitar que los organismos a los que buscan eliminar desarrollen resistencia frente a ellos. Ante la respuesta de adaptación a esta clase de medicamentos, es necesaria la obtención de unos nuevos o de mejora de los existentes, de tal forma que podamos seguir combatiendo las infecciones bacterianas de forma eficiente. Una de las formas de conseguir mejorar la productividad de esta clase de medicamente es mediante la INGENIERÍA METABÓLICA.

Dentro de los antibióticos hay gran variedad de grupos, pero los más conocidos son los β-lactámicos, total, ¿quién no ha escuchado nunca hablar de la penicilina? Dentro de esto grupo aparecen otra familia de antibióticos, conocidos como las cefalosporinas que son superiores a las penicilinas. ¿Por qué? Porque presentan un mayor espectro (son capaces de atacar a mayor variedad de patógenos), mayor potencia (son más efectivos frente a ellos), baja toxicidad (no nos hacen demasiado daño a nosotros) y presentan resistencia a la β-lactamasa (enzima que ataca a los antibióticos penicilánicos y los degrada, y por tanto, hace a las bacterias resistentes frente a ellos).

Acremonium

Hasta aquí todo bien, salvo un pequeño problema: el organismo productor de las cefalosporinas es Acremonium chrysogenum  que presenta un rendimiento más bien bajo. Para solucionar esto se modificó el genoma de otro microorganismo, muy conocido dentro de la biotecnología, Penicillium chrysogenum que es capaz de producir un metabolito, el primero de la ruta de biosíntesis de la ruta de las cefalosporinas, llamado: 7-ADCA (ácido adipoil-7-aminodesacetoxicefalosporánico y... SÍ, YO TAMBIÉN HE TENIDO QUE LEERLO VARIOS VECES PARA QUE SUENE ALGO CON SENTIDO EN MI CABEZA, MALDIGAMOS A LOS QUÍMICOS ORGÁNICOS POR TALES PALABROS, NO PODÍAN LLAMARLO EUFRASIO)

Veamos cómo lo hacen:

Penicillium

Primero obtienen el gen cefEF de A. chrysogenum. Pero la pregunta es…. ¿cómo se puede hacer eso? Pues vamos a verlo, ¿no? Existe una técnica dentro de la biología molecular, cuyas iniciales son PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que consiste en la obtención de un fragmento de ADN que aparece flanqueado por dos secuencias de ADN que nosotros conocemos. Lo que hacemos es introducir dos fragmentos complementarios a esas secuencias flanqueantes, conocidos como primers, en la reacción y que restringe el fragmento que vamos a amplificar, a través de una serie de reacciones encadenadas y cíclicas amplificamos este ADN y lo recuperamos (aquí teneís un vídeo explicatorio de la PCR y... ¡¡CON ACENTO ARGENTINO!! http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU). En los primers nosotros podemos introducir ciertas modificaciones, como por ejemplo, regiones de corte de enzimas de restricción, que son las tijeras de los biólogos moleculares. Estas enzimas cortan esta secuencia y luego gracias a las ligasasas, que serían el pegamento, podemos llevarnos nuestro fragmento de interés a un plásmido, que sería el almacén. Los plásmidos son ADN circular y en nuestro caso presenta una zona que determinará que se sintetice nuestra proteína (el promotor) y otra zona que determinará el final de la trascripción (el terminador).

Pues bien, esta técnica se aplica en dos genes diferentes, uno es conocido como cefEF y que corresponde (la palabra correcta es ‘codifica’) a una proteína llamada expandasa/hidroxilasa, que se encarga de reestructura el metabolito, de tal forma que pase de la familia de la penicilina a la familia de la cefalosporina, y además la modifica, añadiéndole un grupo –OH, la hidroxila.

Streptomyces

Por otro lado, se obtiene otro gen, este Streptomyces clavuligerus, y que responde al nombre cmcH, codificando a una enzima conocida como 3’-hidroximetilcefen-O-carbamoiltransferasa, que se encarga de modificar de nuevo el metabolito (carbamoilación), sobre la modificación que produjo la anterior enzima, produciendo así el metabolito final que queríamos obtener adACCA (venga, os prometo que ya es el último palabro: ácido adipoil-7-amino-3-carbamoiloximetil-3-cefem-4-carboxílico).

Estos dos genes se introducen plásmido y una vez lo tenemos se lo metemos (transformamos, o mejor dicho, al meter dos plásmidos co-transformamos) a P. chrysogenum, lo que nos dará una cepa productora de el antibiótico, que servirá como base para la síntesis química de gran cantidad de antibióticos.

Así es como a partir de la introducción de sólo dos genes, hemos conseguido generar un nuevo organismo productor de antibióticos. ¿Es o no es útil la ingeniería metabólica?

Si quieres ver la ruta completa, haz click aquí.

Fuente: Engineering of Penicillium chrysogenum for fermentative production of a novel carbamoylated cephem antibiotic precursor. Diana M. Harris et al. Metabolic Engineering 11 (2009)

Presentación

Saludos,

inauguro este blog con la ilusión de dar a conocer algo que, en general es bastante desconocido. Esto hablando de la Ingeniería Metabólica. Y la pregunta es... ¿eso qué es? Pues bien, buscando la definición del hombre que creó la Ingeniería Metabólica, el gran Gregory Stephanopoulos: “técnicas de optimización genética y de los procesos regulatorios en la célula para incrementar la producción de una cierta sustancia”. Todo esto se hace gracias a técnicas de ingeniería genética que serán cada una diferente en función del organismo en el que trabajemos y el tipo de mejora que se busque.

Sabiendo esto podemos hablar de que la ingeniería metabólica es como un lego, consiste en tomar las piezas (enzimas) que forman el puzzle que es el metabolismo del organismo y jugar con ellas, de tal forma que hagamos que sean mejores, lo que aceleraría la reacción que catalizan; empeorarlas lo que haría que se ralentizase; hacer que desparezcan; o incluso llevárnosla de un organismo a otro.

¿Esto para qué sirve? Vamos a resolver dudas por partes:

• Mejorar una enzima: en el metabolismo aparecen unos puntos llamados 'cuello de botella' en el que la velocidad de la ruta metabólica se ralentiza, y por más que mejoremos el resto de enzimas la velocidad no aumenta. Serían una especie de diques metabólicos. Mediante diferentes técnicas que desgranaremos en subsiguientes post podemos hacer que la velocidad de esta reacción catalítica aumente, mejorando la velocidad de la ruta.
• Empeorar una enzima: en el metabolismo encontramos que una misma molécula o metabolito puede seguir distintas rutas. En ocasiones nos interesa que nuestra molécula en cuestión se dirija hacia una ruta, pero que mayoritariamente se dirige por otra. Podemos pensar "¿y por qué no eliminamos la enzima que cataliza la ruta que no nos interesa?" Pues bien, la respuesta es que en ocasiones, a ruta que nos baja nuestro rendimiento es imprescindible para la célula y, si desaparece, la célula no se puede desarrollar. Una solución de compromiso es 'dejar tocada' la enzima, de tal forma que siga funcionando, pero a un ritmo más lento.
• Eliminación (knock-out) de una enzima: pues si la ruta por la que va el metabolito no es imprescindible podemos eliminar la primera enzima, lo que hará que toda la molécula de interés vaya por la ruta que queremos.
• Traslado de la ruta a otro organismo: consiste en tomar el gen o los genes implicados en la ruta de interés de un organismo que la posea a otro que no o cuyo rendimiento sea menor.

Esto es sólo una introducción, para que veáis lo que se puede hacer gracias a las técnicas de esta nueva ingeniería. Intentaré tener esto más o menos actualizado, subiendo ejemplos de lo que se hace para que veáis la aplicación que esto tiene y os pondré las referencias a los artículos que he usado para elaborar el post. Me gustaría que este blog fuera interactivo entre vosotros y yo, que me propusierais temas que os interesen, que me preguntéis dudas que surjan,  y sobre ello ampliar y exponerlo por aquí, igual que sí veis que aparece algún error o algo que se queda desactualizado que me lo hagáis saber. Para ello podéis contactar con la cuenta de Twitter @metablogismo